目前现有的许多癌症疗法，都是通过细胞凋亡来杀死癌细胞。然而，癌细胞很“聪明”，很多癌细胞能够找到方法逃避治疗诱导的凋亡，导致治疗耐药和疾病复发。
今天，梅斯学术小编为大家带来一篇发表在Nature Cell Biology杂志上的文献[1]：Actin cytoskeleton vulnerability todisulfide stress mediates disulfidptosis，该研究提出了一种新型细胞死亡方式——双硫死亡，有望作为一种新的癌症治疗方法。下面，就来看看该研究是如何开展的吧！
一、研究背景
(相关资料图)
细胞内二硫化物（如胱氨酸）的异常积累，会诱发二硫化物应激，对细胞有剧毒。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸盐（NADPH）的还原形式，则提供了关键的还原能力，以抵消二硫键应激，并维持细胞存活。
胞质NADPH池主要由葡萄糖通过磷酸戊糖途径产生。在胱氨酸转运蛋白溶质载体家族7成员表达异常的癌细胞中，胱氨酸摄取率高，胱氨酸还原为半胱氨酸，当与葡萄糖饥饿相结合时，则会耗尽NADPH池，导致细胞内二硫分子大量积累和细胞快速死亡。然而，这种细胞死亡的性质仍然未知。
二、研究内容及套路
一、葡萄糖匮乏的SLC7A11高表达癌细胞中一种独特细胞死亡形式
首先，研究者使用现今已知的多种细胞死亡抑制剂来预防葡萄糖饥饿诱导的SLC7A11高表达癌细胞死亡，结果发现这些方法均无法挽救细胞死亡，可见葡萄糖饥饿诱导的SLC7A11高表达癌细胞死亡细胞死亡并非细胞凋亡或铁死亡等已知的细胞程序性死亡方式。
进一步研究发现，SLC7A11高表达在一定程度上恢复了葡萄糖饥饿导致的ATP降低，表明SLC7A11促进葡萄糖饥饿诱导的细胞死亡不是由于ATP耗竭引起的。
之前有些研究发现，防止二硫键积累能有效地抑制葡萄糖饥饿诱导的SLC7A11高表达癌细胞死亡。因此，可以合理猜测这种类型的细胞死亡与二硫键应激有因果关系。
于是，研究者使用二硫化物还原试剂抑制，发现其显著增强葡萄糖饥饿条件下SLC7A11高表达癌细胞导致的细胞死亡。因而研究者们将这种细胞死亡命名为——双硫死亡（Disulfidptosis）。
套路：提出一种新型细胞死亡方式的第一步是——排除其它细胞死亡方式的干扰，揪出真正影响并诱导该新型细胞死亡产生的因素，最后进行验证。
二、葡萄糖匮乏的SLC7A11高表达癌细胞蛋白质组学分析
研究团队提出假设：葡萄糖饥饿时，SLC7A11高表达癌细胞中NADPH耗竭和二硫化物应激会诱导某些蛋白上半胱氨酸的巯基之间形成分子间和/或分子内二硫键，进而破坏相应蛋白的活性和功能，造成细胞死亡。
为了验证这一假设，研究者应用了一种生物正交化学蛋白质组学策略，揭示了葡萄糖饥饿诱导的SLC7A11高表达癌细胞在肌动蛋白细胞骨架蛋白中诱导二硫键。
套路：明确细胞死亡方式后，下一步便是了解其作用机制——采用蛋白质组学进行分析，从而获得与这一死亡方式相关的蛋白。
三、双硫死亡中细胞骨架蛋白中的二硫键
接着深入挖掘，已知二硫键的形成会影响蛋白质在非还原条件下的电泳迁移率。研究者试图使用非还原性蛋白质印迹验证葡萄糖饥饿诱导的二硫键在鉴定的肌动蛋白细胞骨架蛋白中的二硫键形成，最终发现这些肌动蛋白细胞骨架蛋白在葡萄糖饥饿下形成多个分子间二硫键，但显著的细胞死亡（大于10%）则发生在4小时以后，表明这不太可能是细胞死亡的次要后果。
接下来，研究者进一步分析了铁死亡与二硫化的区别——虽然二者均存在胱氨酸摄取，但二硫化增加了细胞NADP/NADPH比率，而铁死亡却没有。
研究者进一步验证了葡萄糖饥饿诱导肌动蛋白和其他肌动蛋白细胞骨架蛋白之间混合二硫键的假设，确认在未使用还原剂DTT和封闭剂碘乙酰胺（IAA）处理的样品中鉴定出二硫键合，而在经过处理的样品中未鉴定出二硫键。最终证实：SLC7A11高表达细胞的胱氨酸摄取与葡萄糖饥饿相结合时，诱导严重的二硫应激，随后以非ROS依赖的方式促进肌动蛋白细胞骨架蛋白中的异常二硫键形成。
套路：大范围筛选获得与双硫死亡相互作用的蛋白之后，便是进一步缩小范围——从二硫键的形成过程入手，深入挖掘其分子机制。
四、双硫死亡中F-actin的收缩
接下来，研究者们进一步检测了双硫死亡过程中肌动蛋白细胞骨架的动态变化。
葡萄糖饥饿诱导细胞形态的显著变化，其特征在于细胞收缩和F-actin蛋白收缩。肌动蛋白丝与膜染料的共染色显示葡萄糖饥饿诱导肌动蛋白丝快速收缩，并且在明显的细胞死亡前与细胞质膜剥离。
这表明，肌动蛋白丝在双硫死亡中可能具有重要作用。
套路：在葡萄糖饥饿诱导的SLC7A11高表达细胞中，Actin细胞骨架相关的蛋白质多个位点形成了二硫键。但究竟是哪些蛋白分子起主导作用？这些二硫键变化究竟导致了何种表型？导致细胞死亡？
五、Rac1-WRC监管双硫死亡
为了深入探究葡萄糖饥饿和SLC7A11高表达引起F-Actin收缩的具体机制，研究者进行了全基因组CRISPR/Cas9筛选，在双硫死亡所需基因列表中，SLC7A11和SLC3A2排于首列。有趣的是，排在第四的是NCKAP1，WRC的一个组成亚基；WRC促进肌动蛋白聚合和片状伪足形成，在细胞质膜下方形成一个分支的肌动蛋白网络皮层。进一步验证发现，NCKAP1敲除确实明显减缓了双硫死亡。
进一步研究表明，NCKAP1缺失并不影响SLC7A11和SLC3A2蛋白水平、胱氨酸摄入或NADP+/NADPH比率，但是减弱了葡萄糖饥饿诱导的二硫键形成、肌动蛋白骨架收缩以及与细胞质膜的脱离。WRC的一个特点是，其5个亚基当中任何一个缺失都会导致整个复合物降解。研究发现，敲除WRC其它亚基也会减缓双硫死亡。另外，一般情况下WRC处于抑制状态，其受Rac1激活以促进细胞片状伪足的形成。进一步研究表明，Rac1的组成型活性突变体（Rac1 Q61L）的过表达，促进细胞片状伪足形成和双硫死亡。
总之，这些数据表明：Rac-WRC介导的片状伪足形成促进了双硫死亡，这可能是因为片状伪足中的肌动蛋白网络分支为二硫化物应激提供了关键靶点。
套路：肌动蛋白丝在双硫死亡中可能具有重要作用，接下来需要对其进行进一步的验证以及寻找靶点位置。
六、GLUT抑制剂诱导SLC7A1高表达癌细胞中的双硫死亡
葡萄糖转运蛋白GLUT1抑制剂BAY-876和GLUT1/3抑制剂KL-11743，能够有效抑制细胞的葡萄糖摄入，进而在SLC7A11高表达癌细胞中造成NADPH消耗、肌动蛋白细胞骨架交联和双硫死亡。
研究者使用葡萄糖转运蛋白（GLUT）抑制剂BAY和KL分别进行处理，并检测不同细胞程序性死亡抑制剂的效果，最终表明：与葡萄糖饥饿类似，GLUT抑制诱导SLC7A11高表达癌细胞中的双硫死亡。此外，Actin相关蛋白的二硫键形成和F-actin收缩均与葡萄糖饥饿时相同。小鼠实验证明：GLUT抑制剂能有效促进双硫死亡，抑制SLC7A11高表达肿瘤细胞生长。
套路：到第五张图时，故事基本讲述结束——既然双硫死亡是在葡萄糖饥饿条件下发生，那阻断葡萄糖摄取会不会带来同样的结局呢，并开展相应的研究。
三、小结
该研究提出了一种新型细胞死亡方式——双硫死亡。这种死亡方式独立于目前现存的凋亡、铁死亡、坏死性凋亡、铜死亡等细胞程序性死亡，给予研究者新的细胞程序性死亡研究启发。
纵观全文，双硫死亡的研究手法和铜死亡研究思路存在相似之处，皆是从已有程序性死亡方式入手，使用对应的细胞程序性死亡方式抑制剂进行一一排除，加上现有数据库或研究内容找到新型死亡方式的诱导因素，从而命名，再通过蛋白质组学和CRISPR筛选最终锁定了其中的分子机制。
参考文献：
撰文：MIE
